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Circulating free DNA甲基化解决方案

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应用案例

 

提供cfDNA甲基化全方位技术解决方案

 

cfDNA (circulating-free cell DNA), 又称循环 DNA 或无细胞DNA, 是指存在于血浆或血清的细胞外DNA

ctDNAcirculating tumor DNA)携带了肿瘤基因组一定的突变信息(SVindelCNV)

还携带表观修饰信息5mC甲基化和5hmC羟甲基化及结构信息(片段长度、断裂特征等)

其中DNA甲基化5mC修饰具有独特的应用价值,广泛用于肿瘤疾病早筛早诊、复发预后等应用

 

 

 

 

基于cfDNA甲基化biomarker筛选技术路线

潜在甲基化biomarker筛选步骤,结合样本及成本的实际情况,按照以下3种方式进行:

1、以现有的TCGA甲基化芯片数据库进行筛选潜在的biomarker及建模;

2、从肿瘤组织样本入手,筛选肿瘤特异性的biomarker,推荐最高性价比的RRBS方案;

3、直接以血浆/血清cfDNA样本进行WGBS测序筛选biomarker及建模。

 

 

在验证步骤,对潜在的biomarker及模型的验证,

通常采用靶向甲基化Panel对大样本血浆/血清cfDNA的临床验证。

 

 

完整解决方案,服务每一个项目

艾斯基因专注表观组学10年,提供专业的DNA甲基化完整解决方案;

已经完成3000+例样本cfDNA甲基化项目经验;

解决从血液采集保存、cfDNA分离提取(>90%得率)

低至15ng输入量的微量全基因组甲基化文库构建,

cfDNA靶向甲基化Panel定制测序一整套核心技术方案;

全方位助力cfDNA甲基化biomarker筛选及转化应用。

 

 

 

技术方案及样本要求

样本/文库类型

样本要求

850K甲基化芯片 (组织样本)

总量≥ 1ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

WGBS/RRBS (组织样本)

总量≥ 1ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

cfDNA WGBS (血浆样本)

建议提供1-4ml血浆/血清, 或者>15ng cfDNA

甲基化Panel (血浆样本)

建议提供1-4ml血浆/血清, 或者>15ng cfDNA

备注用封口膜密封样品; 干冰运输

 

 

cfDNA样本准备注意事项

在体内cfDNA在血浆里核酸酶的作用下,不断降解消失,

同时新的ctDNAcfDNA进入血浆中,维持一定的动态和半衰期;

抽血离体之后ctDNA会继续降解、含量逐步减少,

而来自白血细胞的cfDNA持续进去血浆,进而稀释ctDNA浓度,降低检测信号。

因此,在采血、血浆分离及保存运输,每一步操作都会影响数据的质量

 

抽血及暂存注意事项

EDTA抗凝管

2-8度冰箱暂放;在8小时内低温离心分离血浆

Streck等采血管

2-8度冰箱或者常温暂放;在48小时内离心分离血浆

注意:全血样本在分离出血浆之前,千万不要冷冻保存

血浆分离

采取两轮离心分离血浆,4℃条件下以 1600g 离心10min

4℃条件下以 16000g 离心10min

要求EDTA抗凝管采血管需要低温条件离心;

Streck等采血管建议低温离心,也可以常温离心,不受到影响

保存及运输

分离的血浆存放于-80℃冰箱保存(3年内都可以); 使用干冰运输。

cfDNA提取产量

cfDNA的含量存在较大的波动及异质性;

一般正常人及肿瘤早期, 5-15ng/ml血浆;

肿瘤晚期或者化疗等病人, cfDNA浓度显著提高

 

为了结果的稳定性和一致性,

我们建议使用Streck等采血管替代普通的 EDTA抗凝管,

对于合作项目,艾斯基因免费提供专门的采血管!

 

 

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目前基于cfDNA甲基化biomarker筛选技术路线,结合样本及成本的实际情况,按照以下3种方式进行

 

技术路线1:以现有的TCGA甲基化芯片数据库进行筛选潜在的biomarker及建模

案例分析:循环肿瘤DNA甲基化biomarker用于肝癌诊断和预后

Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater. 2017;16(11):1155-1161.

本课题通过TCGA数据库筛选401个甲基化Biomarker, 1933例血浆中进行基于靶向亚硫酸盐测序(Targeted Bisulfite Sequncing, TBS) ,通过与临床样本信息进行关联分析,最终筛选了10HCC诊断和8HCC预后预测的甲基化Biomarker.

 

 

 

技术路线2从肿瘤组织样本入手,筛选肿瘤特异性的biomarker,推荐最高性价比的RRBS方案

案例分析:血清游离DNA甲基化biomarker用于乳腺癌转移早期筛查

Methylation patterns in serum DNA for early identification of disseminated breast cancer. Genome Med. 2017;22;9(1):115.

本课题通过RRBS检测了31个样本,其中癌组织(n=8)和白细胞(n=23)DNA甲基化,筛选出18个癌症特异的DMR, 进一步通过TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 在两个样本库(>1000)的血浆cfDNA中验证,找到血清EFC#93用于早期识别弥散性乳腺癌的biomarker.

 

 

 

技术路线3:直接以血浆/血清cfDNA样本进行全基因组甲基化测序筛选biomarker及建模

案例分析:血浆DNA甲基化分析提示EBV病毒相关疾病的病因

Methylation analysis of plasma DNA informs etiologies of Epstein-Barr virus-associated diseases. Nat Commun. 2019;10(1):3256

本研究通过对鼻咽癌 (NPC, N=15)EBV相关性淋巴瘤 (n=9) 和传染性单核细胞增多症患者 (N=5) 的血浆游离cfDNA进行WGBS测序分析,发现EBV DNA甲基化图谱呈现疾病相关模式。这表明在鼻咽癌诊断中进行血浆EBV DNA甲基化分析具有重要的潜力。

 

 

 

EBV相关疾病的特异性血浆EBV DNA甲基化聚类

 

 

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